서   론

산성광산배수(Acid Mine Drainage, AMD)는 폐광지역에서 황화광물의 산화과정을 통해 발생하며 주변 수계에 다량의 중금속 오염을 유발한다. 황화광물의 산화는 화학적으로도 진행될 수 있으나 황산화 미생물(sulfur-oxidizing bacteria)과 철산화 미생물(iron-oxidizing bacteria)에 의해 더욱 빠르게 진행되는 것으로 알려져 있다(Singer and Stumm, 1970; Nordstrom and Southam, 1970; Nordstrom and Alpers, 1999). 특정 미생물에 의한 황산화 및 철산화 과정에서 발생한 광산배수는 고농도의 중금속(Cu, Zn, Mn, Fe, As, Cd 등)을 포함하고 있어 광산 주변 환경에 심각한 문제를 야기한다.

황산염환원 미생물(Sulfate Reducing Bacteria, SRB)은 황산화 미생물과 반대로 중성 pH 조건에서 유기물을 탄소원으로 활용하여 산화상태의 황산염을 환원시킨다. 이때 환원된 황은 용액 내 중금속들과 결합하여 침전하고 이러한 과정을 통해 용액 내 중금속 농도를 감소시킨다. SRB가 활용가능한 유기물로는 유산염(lactate) 및 피루브산염(pyruvate; Gibert et al., 2004; Rabus et al., 2013), 버섯퇴비(Neculita et al., 2011), 비료와 톱밥(Wang and Zhang, 2014) 등이 있다. 미생물에 의한 황산염환원의 기작은 광산배수 발생 기작인 황화광물의 산화와 반대되는 것으로 용출된 비소와 황산염을 광물상으로 재침전시켜 제거할 수 있다. O‛Day (2004)는 환원조건에서 미생물에 의한 황산염환원과정에서 FeS, AsS가 형성될 수 있음을 규명하였다. 또한 Kirk 등(2010)은 철과 황의 환원을 통해 mackinawite, greigite, pyrite가 침전하여 환원환경에서 비소의 거동에 영향을 미칠 수 있음을 규명하였다.

이러한 결과는 적절한 유기물을 공급하여 SRB의 대사를 유도함으로써 광산배수 내 중금속, 특히 비소의 제거가 가능함을 보여준다. 생물학적 대사활동을 유도하여 중금속의 거동을 제어하는 방법은 산업폐수 처리 등 다양한 분야에서 활용하고 있다(Barakat, 2011; Quan et al., 2003). 광해방지 분야에 있어서도 소택지와 SAPS (successive alkalinity- producing system) 등을 이용하여 광산배수 내 중금속을 제거한다(Yim, 2002; Cheong et al., 2012; Ji et al., 2012). 그러나 몇몇의 경우 기대했던 중금속 제거가 진행되지 않는 결과를 보이기도 하였는데 이는 운전과정에서 나타나는 막힘(clogging)현상, SRB의 낮은 활성도, 부적절한 유기물의 사용 등이 원인이다. 부산광역시 기장군에 위치한 일광광산의 경우 소택지를 건설하여 광산배수 정화를 진행하였으나 소택지 유출수에서 기대했던 수질개선효과를 달성하지 못하였다(Choi, 2005).

이 연구에서는 SRB에 의한 황산염환원과정에서 용액 내 As 제거 기작을 규명하고 황산염환원 생물반응기를 활용한 광산배수의 As 제거 적용성을 평가하였다. 실험에 사용한 SRB는 As로 오염된 토양으로부터 분리하였으며 유전자 정보를 확보하여 분리한 SRB의 특성을 규명하였다. 또한 분리한 SRB가 형성한 황화물과 반응을 통한 As 제거 기작을 규명하여 광산배수 내 As 제거에 활용가능성을 평가하였으며 실제 As를 포함한 광산배수 정화에 활용하였다.

연구방법

황산염환원 미생물 분리 및 As 내성평가

미생물학적 황산염환원 과정을 통한 용액 내 비소 제거 기술을 활용하기 위해 비소로 오염된 토양으로부터 SRB를 분리하였다. SRB를 분리하기 위한 토양은 충청남도 청양의 구봉광산 주변 논토양에서 채취하였다. 채취한 토양은 구봉광산에서 유실된 광물찌꺼기 및 폐석에 영향을 받아 비소의 함량이 높은 지역으로 알려져 있으며 토양 내 비소의 전함량은 약 145 mg/kg으로 나타났다(Ko et al., 2010). 토양은 약 80 cm 깊이의 심부토양을 사용하였으며, Postgate B (Postgate, 1984)배지를 이용하여 토양 내 SRB를 분리하였다. 채취한 토양 10 g을 고압멸균기를 이용하여 멸균한 증류수 100 mL와 혼합하여 30분 동안 N₂ 가스를 주입하여 산소를 지속적으로 차단하며 교반하였다. 이후 10 mL의 상등액을 취하여 미리 준비한 Postgate B 배지에 접종하고 30°C에서 분리 배양을 실시하였다. 초기 분리를 실시한 후 SRB의 존재 여부는 검은색 침천물의 형성을 통한 육안 관찰을 통해 실시하였으며, 이후 지속적인 계대배양을 통해 SO₄^2-의 농도 변화를 주기적으로 관찰하여 황산염환원을 확인하였다.

분리한 SRB가 As가 존재하는 조건에서 대사활동을 통해 황산염환원 산물을 생성하는지의 여부를 확인하기 위해 실험을 실시하였다. SRB의 As 내성농도 범위를 확인하기 위해 Postgate B 배지에 As(V)의 초기 농도를 0.001 mg/L, 0.005 mg/L, 0.01 mg/L, 0.1 mg/L, 0.5 mg/L, 1 mg/L, 5 mg/L로 조성하였다. 다양한 As(V) 농도로 조성한 배지에 SRB를 접종한 후 30°C에서 배양하며 배지 내 검은색 침전물의 형성 여부로 SRB가 갖는 As 내성 범위를 판단하였다. 실험에 사용한 SRB가 As에 노출된 환경에서 대사활동을 할 수 없다면 광산배수 내 As 제거에 적용할 수 없게 될 것이다. 따라서 이 내성평가 실험은 As 오염토양으로부터 분리한 SRB를 광산배수 내 As 제거 기작에 적용할 수 있는지의 여부를 판단함과 동시에 생물반응기를 적용할 수 있는 As 농도범위를 결정할 수 있는 자료를 제공할 수 있다.

As 오염 토양으로부터 분리한 SRB 동정(identification)

분리한 SRB의 종을 확인하기 위해 수차례 계대배양 후 DNA를 추출하여 16s rRNA를 통한 시퀀싱(sequencing)을 실시하였다. 분리한 SRB의 DNA추출은 Promega사의 genomic DNA purification kit를 이용하여 실시하였으며, 추출 과정은 Promega에서 제공하는 방법에 따라 cell pellet 형성, cell lyse, protein precipitation, DNA precipitation의 순서로 진행하였다. 추출한 DNA는 마크로젠에 의뢰하여 PCR (polymerase chain reaction)을 진행하고 16s rRNA 시퀀싱을 실시하여 유전자 정보를 분석하였다. As 오염토양으로부터 분리한 SRB의 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST (basic local alignment search tool)기능을 이용하여 동정을 실시하였으며, MOTHUR (v.1.7.2)와 MEGA (molecular evolutionary genetics analysis) 프로그램을 이용하여 이미 알려져 있는 SRB와의 유사도 분석을 통해 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다.

생물학적 황산염환원 산물에 의한 용액 내 비소 제거

As 오염 토양으로부터 분리한 SRB의 대사과정에서 형성된 황산염환원 산물이 용액 내 As(III) 및 As(V)의 제거에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 실험은 Postgate B 배지 100 mL에 SRB 5 mL를 접종하여 배양하고 약 7일 경과 후 As(V)와 As(III) 용액을 주입하였다. 이 때 초기 주입한 As(V)와 As(III)의 농도는 각각 12.4 mg/L, 9.3 mg/L이다. 이후 15일 및 30일에 각각의 상등액을 채취하여 As(V)와 As(III)의 농도 변화를 측정하였으며 반응 이후 침전물을 회수하여 SEM-EDX (Hitachi S-4700) 분석을 통해 침전물의 표면 특성 및 화학조성을 관찰하여 침전물 내 As의 존재여부를 확인하였다.

광산배수 내 As 제거를 위한 대용량 황산염환원 생물반응기 적용성 평가

As 오염토양으로부터 분리한 SRB를 활용하여 광산배수 내 As 제거를 확인하기 위해 대용량의 황산염환원 생물반응기를 설치하고 광산배수를 통과시켜 비소농도 변화를 관찰하였다. 황산염환원 생물반응기의 규격은 1.2 m(D) × 1.3 m(H)로 하부에 유공관을 설치하고 석회석과 폐상퇴비를 3:7로 혼합하여 충진하였다. 이때 폐상퇴비는 양송이 재배 후 퇴비로 사용되는 배양토로서 생물반응기에 주입한 SRB의 기질물질로 활용 가능한 것으로 판단하였다. 황산염환원 생물반응기 적용 실험은 전라남도 보성의 두문골 광산에서 수행하였다. 두문골 광산의 광산배수는 As 이외에 다른 중금속 함량이 매우 낮아 이 실험에 매우 적합한 것으로 판단하였다. 두문골 광산의 광산배수는 pH 7.3의 중성영역으로 비소 농도가 약 300 µg/L이었으며, 유출되는 갱내수는 약 50 L/min으로 빠르게 하천으로 유입되어 주변 수계에 비소 오염을 유발하는 것으로 나타났다.

결과 및 토의

황산염환원 미생물 분리 및 As 내성평가

높은 농도의 비소로 오염된 구봉광산 주변 논토양에서 SRB의 존재를 확인하기 위해 Postgate B 배지를 사용하여 관찰한 결과, 초기 접종 후 약 10일이 경과하자 검은색의 침전물이 형성되었다. 검은색의 침전물은 SRB의 대사활동에 의해 SO₄^2-가 환원되면서 FeS 형태의 황화철(iron sulfide)이 형성된 것으로 SRB의 존재를 나타내는 중요한 인자이다(Church et al., 2007; Zhang and Wang, 2016). 검은색 침전물의 형성을 통하여 SRB 존재를 확인한 이후 우종의 SRB를 확보하기 위해 지속적인 계대배양을 실시하였으며 실험이 진행되는 동안 주기적으로 SO₄^2- 농도 변화를 확인하였다. 수 차례 계대배양을 통해 SO₄^2-의 농도변화를 확인한 결과, 배양 직후 약 10 mg/L의 초기 SO₄^2-의 농도가 시간이 경과함에 따라 점차 감소하는 것으로 나타났다 (Fig. 1). 특히 3일이 경과하며 용액 내 SO₄^2-의 농도가 급격히 감소하는 것으로 나타났으며 배양액의 색 변화에서도 3일 이후 급격히 검은색으로 변화하는 양상을 보였다. 이러한 결과는 배양액 내 SRB가 3일이 경과하며 지수성장 단계에 들어감에 따라 대사활동이 급격하게 빨라져 나타나는 변화로 판단되었다.

다양한 As 농도 조건 하에서 분리한 SRB의 성장 여부를 확인한 실험에서는 시간이 경과함에 따라 SRB가 고농도의 As에 점차 적응하는 결과를 보였다(Fig. 2). 약 15일이 경과하자 초기에 주입한 As 농도 0.001 mg/L, 0.005 mg/L, 0.01 mg/L에서 검은색의 침전물이 확인되어 접종한 SRB가 잘 성장하는 것으로 나타났다. 이러한 배양액의 변화는 시간이 경과하면서 높은 농도의 As를 주입한 실험에서도 나타났으며 약 40일이 경과하자 0.5 mg/L의 높은 As 농도에서도 접종한 SRB가 성장한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 용액 내 As가 미생물의 성장을 저해할 수 있으나, 시간이 경과함에 따라 실험에 사용한 SRB가 일정 농도의 As에 대해 저항성을 갖고 성장할 수 있음을 보여준다.

As오염 토양으로부터 분리한 SRB 동정

분리한 SRB의 gDNA를 추출하여 16s rRNA를 통해 유전자 정보를 분석하고 동정을 실시하였다. NCBI에 blast search한 결과 Clostridium tyrobutyricum으로 확인되었으며 유사도는 97.5%로 나타났다. C. tyrobutyricum의 황산염환원에 관한보고는 아직 없으나 비소와 황산염을 환원하는 환경의 퇴적토에서 분리한 복합 균주체에 Clostridium 속에 해당하는 C. quercicolum이 존재하는 것으로 보고된 바 있다(Newman et al., 1997). 이는 Clostridium 속에 해당하는 특정종이 황산염을 전자수용체로 활용할 수 있음을 시사하는 것이다. 분리한 미생물을 배양하는 단계에서 나타난 황산염의 농도 변화와 검은색의 침전물 형성 과정에서 나타난 용액의 색 변화는 많은 SRB의 배양 과정에서 나타나는 결과로서 C. tyrobutyricum은 황산염을 전자수용체로 활용하는 SRB인 것으로 판단된다.

SRB로 잘 알려진 Desulfotomaculum nigrificans, Desul-fovibrio gracilis,Desulfosporosinus orientis 와 비교를 통해 계통수를 작성하였다(Fig. 3). As 오염토양으로부터 분리한 SRB는Desulfosporosinus orientis 와 유사한 그룹으로 분류할 수 있으며 bootstrap value가 90으로 나타났다. Church 등(2007)은 광산퇴적물로부터 분리한 미생물에서 Desulfosporosinus sp.와 Clostridia가 98%의 유사도를 보인다는 결과를 보고한 바 있으며, 이러한 결과는 이 실험에서 분리한 SRB가 Desulfosporosinus sp.와 유전적으로 유사함을 보여주는 결과라고 할 수 있다.

생물학적 황산염환원 산물에 의한 용액 내 비소 제거

SRB의 대사활동에 의해 형성된 황산염환원 산물에 의해 As의 제거여부를 확인한 실험에서 10일 및 30일 경과 후 용액시료를 채취하여 용액 내 As(V) 및 As(III)의 농도변화를 확인하였다. SRB를 배양하여 침전물이 형성된 100 mL의 배지에 As(III)를 주입한 실험에서는 초기 9.2 mg/L에서 10일 경과 후 6.7 mg/L, 30일 경과 후 4.6 mg/L의 농도를 나타내어 30일 동안 4.6 mg/L의 As(III)가 제거되었다(Fig. 4). As(V)의 경우 초기에 12.7 mg/L의 농도에서 10일 후 11.0 mg/L, 30일 후 6.3 mg/L의 값을 보여 총 6.4 mg/L가 제거되었다. SRB에 의해 환원된 황 이온과 중금속의 침전 반응은 식 (1)～(3)을 따라 진행되며 이 때 실험에 사용한 SRB는 환원환경에서 식 (1)과 (2)가 진행되도록 유도한다(Luptakova and Kusnierova, 2005).

4H₂ + SO₄^2- + H⁺ → HS^- + 4H₂O             (1)

Organic matter (C, H, O) + SO₄^2- → HS^- + HCO₃^-  (2)

Me²⁺ + HS^- → MeS_(s) + H⁺                  (3)

Me²⁺: metal cations                       

용액 내 비소 농도 저감을 확인한 후 침전물을 회수하여 SEM-EDX 분석을 실시하였다(Fig. 5). SEM을 이용한 침전물의 표면을 관찰한 결과 SRB로 판단되는 다량의 막대모양 개체가 확인되었고 이는 일부 연구자들에 의해 보고된 Desulfovibrio sp.와 유사한 형태를 보인다. 또한 침전물을 대상으로 EDX 분석을 실시한 결과 주로 Fe, S, As로 구성된 것으로 나타나 SRB에 의해 침전된 검은색의 FeS에 As가 흡착 또는 공침(coprecipitation)하여 용액으로부터 제거되었음을 나타낸다.

광산배수 내 As 제거를 위한 대용량 황산염환원 생물반응기 적용성 평가

황산염환원 생물반응기를 활용한 광산배수 내 As 제거과정을 규명하기 위해 보성 두문골 광산에 생물반응기를 설치하여 실험을 진행하였다. 황산염환원 생물반응기에 주입하는 광산배수의 As농도는 약 300 µg/L이며 As 외에 다른 중금속 함량은 매우 낮았다. 실험은 약 70일 동안 진행하였으며 실험이 진행되는 동안 광산배수와 황산염환원 생물반응기를 통과한 유출수의 pH는 7.0 ± 0.5의 결과를 보였다. 이는 황산염환원 생물반응기 통과 전후의 As의 거동에 pH의 영향이 없음을 나타낸다(Fig. 6). 그러나 산화환원전위(ORP)는 유입수와 유출수가 상이한 결과를 보였다. 실험을 진행하는 동안 유입수의 ORP는 평균 160 mV로 나타난 반면, 유출수는 평균 –32 mV로 나타났다. 이러한 상이한 ORP 결과는 황산염환원 생물반응기 내부에 환원환경이 조성되었음을 보여주는 결과로서 SRB의 대사활동이 잘 일어날 수 있는 환경이 조성되었음을 나타낸다. 또한 유입수의 용존산소(DO)는 평균 7.6 mg/L인 반면 유출수는 평균 3.3 mg/L의 값을 보여 약 57%의 용존산소가 감소한 결과를 보였다(Fig. 7). 이는 상대적으로 환원반응이 우세한 환경이 조성되어 미생물학적 처리가 원활히 진행될 수 있음을 의미한다.

황산염환원 생물반응기를 통과한 유출수의 As 농도를 측정한 결과 평균 149.0 µg/L로 나타나 유입수 평균 314.3 µg/L보다 50% 이상 낮은 값을 보였다(Fig. 7). 이는 광산배수 내 As가 황산염환원 생물반응기를 통과하며 황산염환원 산물에 의해 제거된 것으로 판단되며 실험이 진행되는 동안 최대 제거율은 71%로 확인되었다. 이상의 결과로 보아 황산염환원 생물반응기를 이용하여 광산배수 내 As의 제거가 가능할 것으로 판단된다.

결   론

광산배수에 미생물학적 황산염환원 산물에 의한 As 제거를 적용하기 위해 비소에 대해 내성이 있는 SRB를 토양으로부터 분리하고 특성을 확인하였다. 분리한 SRB는 Clostridium tyrobutyricum인 것으로 나타났으며 Desulfos-porosinus orientis와 유전적으로 유사하였다. 실험에 사용한 SRB의 대사과정에서 형성된 황산염환원 산물은 용존된 As(V) 및 As(III)를 약 50% 제거 하였다.

As로 오염된 광산배수가 배출되는 두문골광산에 황산염환원 생물반응기를 설치하여 생물학적 As 제거의 적용성을 확인한 결과 생물반응기를 통과한 유출수에서 평균 50%의 As가 제거된 것으로 나타났다. 이상의 결과는 미생물학적 황산염환원산물에 의한 용존 As의 제거 가능성을 보여준 것으로 일정 부분의 용존산소가 존재하는 환경에서도 As의 제거가 가능함을 나타낸다. 이 연구는 미생물학적 황산염환원에 의한 As 제거 가능성을 보여주었으나, 실제 As오염 광산배수 현장에 적용하기 위해서는 As 제거의 효율을 높이기 위해 반응시간, 미생물의 대사활동 증진, 침전물의 생성 효율 증대와 같은 다양한 연구가 추가적으로 필요하다.